用 pH-1 SMA HP5 测量植物细胞培养中的 真菌代谢物筛选

作为固着的生物，植物不能轻易地通过迁移来规避压力源。为了评估所经历的非生物和生物胁迫的质量和数量，植物已经进化出复杂的信号通路。通常，属于潜在病原体的分子在植物的质膜水平上被识别。识别后，信号会从细胞外部传递到细胞中，如果可能的话，最终会引发防御反应 [1]。在病原体触发免疫 (PTI) 中，一种基础防御反应，信号通常在二级信使 Ca 2+的帮助下传递。细胞外空间含有相对高浓度的Ca 2+，尤其是与细胞质中的浓度并列时。为了对病原体的存在做出反应，Ca 2+离子被转运到细胞中，在转录因子的帮助下改变细胞的行为[2]。这种 Ca 2+的输入与 H +跨质膜的转运结合发生 [3]。质子的运输导致细胞外 pH 值的变化，这很容易量化。pH 值变化是评估植物是否发生 PTI 反应的常用读数。

为了快速连续筛选多种真菌代谢物的免疫活性，需要一个简单可靠的系统来测量由 KIT 微结构技术研究所 (IMT) 与 KIT 植物研究所合作开发的微流体生物反应器 (MBR) 中的 pH 变化。因此，设计了从 PreSens pH-1 SMA HP5 到 MBR 中相应的传感器点 SP-HP5 的可伸缩但可密封的连接器，并在机械和生物实验中进行了检查。MBR 是一个两室生物反应器，用于培养植物细胞（见图 1A）。可渗透膜将培养和营养流动室隔开。它首先由 IMT [4] 的 Tim Finkbeiner 设计，然后进一步发展。细胞可以通过椭圆形腔室两端的两个开口进入培养腔室。开口配有 M5 螺纹，以便用合适的螺钉密封它们。MBR 可以通过单向流连接到更多的 MBR。因此，保留在培养室中的细胞不断地被供应来自先前 MBR 的新鲜培养基和代谢产物，而它们自己的代谢产物被运送到后面的 MBR 并带走废物。基本原理是通过每个 MBR 培养一种细胞来剖析细胞间通讯路径，以获得有关过程和反应的信息。在培养 BY2 细胞系的细胞时，通过 pH-1 SMA HP5 量化 pH 值 持续供应来自先前 MBR 的新鲜培养基和代谢产物，而它们自己的代谢产物被运送到后面的 MBR 并带走废物。基本原理是通过每个 MBR 培养一种细胞来剖析细胞间通讯路径，以获得有关过程和反应的信息。在培养 BY2 细胞系的细胞时，通过 pH-1 SMA HP5 量化 pH 值 持续供应来自先前 MBR 的新鲜培养基和代谢产物，而它们自己的代谢产物被运送到后面的 MBR 并带走废物。基本原理是通过每个 MBR 培养一种细胞来剖析细胞间通讯路径，以获得有关过程和反应的信息。在培养 BY2 细胞系的细胞时，通过 pH-1 SMA HP5 量化 pH 值MBR 培养室中的烟草。可以将待评估免疫活性的物质添加到提供给细胞的培养基中。如果可以观察到 pH 值的增加，则可以将其解释为目标物质具有免疫活性的第一个迹象。

材料与方法

连接设置和机械评估

连接的重要标准是密封生长室，防漏但可拆卸，并提供简单直观的操作。此外，我们的目标是连接器的建筑高度较小，以使系统适合在显微镜下观察。根据这些要求，制造了四种连接器设计。连接器在 MBR 及其性能中进行了测试。光纤的四个连接器（见图 2）由聚碳酸酯 (PC) 制成，因为这是 MBR 的外壳材料。两个连接器设计有盲孔，而另外两个连接器在之后钻孔并密封。对于密封，测试了 PC 箔、简单胶带和聚二甲基硅氧烷 (PDMS)。该方法用于确定，如果由于钻孔工具的划痕而在盲钻连接器中受到阻碍的透明度会影响测量的精度。此外，每种类型的一个连接器都配备了一个额外的凹槽，以便在发生泄漏时容纳额外的密封环作为第二种选择。首先，使用 Leitz Ergoplan 显微镜和 OceanInsight 的 Red Tide USB650 光纤光谱仪，通过测量和比较通过盲孔底部和密封箔的透射率来测试制造的连接器螺钉的透明度. 其次，对制造的连接器螺钉的密封能力进行了测试。使用经过测试的连接器密封 MBR，并连接到注射泵（Harvard Apparatus PHD Ultra）。然后，去离子水 (DI-water) 以 2 mL/min 的稳定流速泵入 MBR。测试持续 15 分钟以确保密封*密封并保持干燥。在对连接器进行泄漏测试后，将 pH-1 SMA HP5 连接到 MBR（图 3 A）。将 pH 传感器点 (SP-HP5) 放置在连接器面向 MBR 内部的一侧，并将连接器拧入 MBR 的开口中。最后，将光纤放置在相应的连接器中，并使用三种不同的 pH 缓冲溶液（pH 6.00、pH 7.413 和 pH 8.00，Carl Roth）一次一个泵送通过系统，以评估光纤的测量性能。传感器连接器。将测量数据与使用 Mettler Toledo SevenCompact S220 作为外部 pH 传感器的缓冲液测量值进行比较。

细胞系和培养设置

对于 BY2 培养测试，使用普通烟草的细胞悬浮培养物在 Murashige 和 Skoog 培养基 (MS) 中培养，含有 4.3 g/L Murashige-Skoog 盐、30 g/L 蔗糖、200 mg/L KH2PO4、100 mg/L 肌醇、1 mg/L 硫胺素和 0.2 mg/ L 2,4-二氯苯氧乙酸。通过将 1.5 mL 的 7 天龄细胞悬液转移到无菌锥形瓶中的 30 mL 新鲜 MS 中，每周对细胞培养物进行亚培养，并在 26°C 下在设置为 150 rpm 的轨道摇床上在黑暗中培养。为了在 MBR 内培养细胞，将 750 µL 7 天大的细胞悬液小心地移入 MBR 的培养室，并使用蠕动泵提供新鲜的 MS 培养基（见图 3B）。流动被组织成通过芯片的单向循环流动。蠕动泵通过管道以 134 µL/min 的速度运行。

壳聚糖引起的 pH 变化的测量

已知壳聚糖可在植物细胞中诱导免疫反应，并相应改变细胞外 pH 值。在这项工作中，在 MBR 中培养的 BY2 细胞用 25 µg/mL 壳聚糖（Sigma Aldrich Chemie GmbH，德国）和相应的 0.0025% 乙酸溶剂对照进行处理。首先，该装置安装在如上所述的洁净工作台中，管道以圆形方式连接 MBR、泵和 MS 介质容器。然后以 134 µL/min 的速度将 MS 介质泵入系统并在第一次到达 MBR 时停止。将 750 µL 7 天大的细胞悬液转移到细胞室中。启动泵，芯片在充满 MS 的同时直立，以促进剩余气泡的排出。一旦 MS 介质开始从芯片的出口流出，芯片就被安装到支架中并最终水平放置。在开始 pH 测量之前，将芯片内的传感器平衡 90 分钟。随后，测量 pH 值 30 分钟以计算基线 pH。然后加入壳聚糖或乙酸并将各自的时间点定义为0:00。处理后，每 30 秒连续测量一次 pH 值，持续 2 小时。对于每种处理，都创建了一个生物学三次。然后加入壳聚糖或乙酸并将各自的时间点定义为0:00。处理后，每 30 秒连续测量一次 pH 值，持续 2 小时。对于每种处理，都创建了一个生物学三次。然后加入壳聚糖或乙酸并将各自的时间点定义为0:00。处理后，每 30 秒连续测量一次 pH 值，持续 2 小时。对于每种处理，都创建了一个生物学三次。

结果与讨论

机械结果

带有用于光纤的钻孔开口的两种连接器设计覆盖有 PC 箔、PDMS 和 3M 聚酯胶带 851（“绿色胶带"），以在培养室和光纤之间形成防漏边界MBR外的光纤。在我们的实验中，PC 箔无法充分粘合，但 3M 聚酯胶带 851 充分密封了连接器插头。然而，由于胶带的绿色和低透光率，这种胶带密封连接器不能用于 pH 测量。PDMS 密封的钻孔也密封不漏。此外，盲钻连接器都充分密封了 MBR。与没有这些的连接器相比，在密封系统方面没有明显的优势，包括额外的凹槽和额外的密封环。

关于透明度，PDMS 密封连接器显示出低的传输率，而 PC 箔密封连接器传输了大约 95% 的光（见图 4）。然而，PDMS 的低传输可能是由于测量设置问题造成的。

接下来，测试连接器传感器设置的 pH 测量精度。由于制造商的 pH 缓冲值与 S220 传感器相比是准确的，因此将测量值与作为参考的给定值进行了比较。MBR 中相关缓冲液的 pH 值以各自的流速测量 3 次，持续 10 分钟（流速为 0 mL/min 和 2 mL/min）和 45 分钟（流速为 0.2 mL/min） . 箱线图是为三个测量的组合数据库生成的（图 5）。确定与给定缓冲值的绝对偏差。对于所有三个 pH 值的所有三个条件，四分位数范围都很小，介于 0.014 pH 到 0.005 pH 之间。除了没有流动循环的 6-pH 缓冲液中的 pH 值评估之外，中值和平均值几乎相同。因此，

图 5：使用不带密封环凹槽的盲孔连接器，使用 pH-1 SMA HP5 测量的 pH 值与缓冲液设定值的绝对偏差。A) 缓冲液：6 pH，B) 缓冲液：7.429 pH，C) 缓冲液：8 pH。

但是，如果将不同的连接器与作为参考系统的玻璃烧杯中的测量值进行比较，则 MBR 中的测量值显示相同缓冲液的测量值明显高于烧杯中的测量值（图 6）。这可能是因为传感器是为玻璃反应器设计的，而不是通过聚合物进行测量。因为不能根据不同的测量光透射率从使用不同的连接器中导出图案，所以假设不同连接器的不同透明度不是测量中偏移的主要原因。

结论

根据我们的实验结果和不同设计，我们得出结论，通过不同连接器设计的光传输似乎不会显着影响测量。然而，与通过玻璃烧杯的参考测量值相比，聚合物连接器的测量 pH 值似乎发生了变化。由于玻璃是传感器指南中规定的适当反应器材料，因此可能需要进行特殊校准以应对玻璃中的光折射，从而在使用聚合物时导致测量值发生变化。如果这种转变可以得到验证——可能通过更多和不同的设置测试——并且具有相应斑点的 pH-1 SMA HP5 传感器将适用于测量我们 MBR 中的 pH 值。

在之前的实验中，我们通过使用使用电极的台式 pH 计测量 pH 值，证实 25 µg/mL 的壳聚糖会导致 BY2 细胞的细胞外 pH 值升高。使用相同的处理，这项工作旨在证明 MBR 和 pH-1 SMA HP5 系统的组合可用于观察与免疫反应相关的细胞外 pH 值增加。开始处理后，15 分钟后可观察到 pH 值显着增加（见图 7）。这种延迟可以通过需要将处理过的 MS 泵入 MBR 的时间来解释。观察到的 pH 变化表明该方法可用于筛选植物细胞上物质的免疫活性。通过使用多个通道和传感器点，将有可能建立一种高通量筛选方法。此外，我们调查了 MBR 培养室由于培养室的椭圆形状而导致的营养梯度的发展。关于这个评估，更大范围内的 pH 值分析，例如，使用 VisiSens 系统，将是有趣的。然而，传感器箔必须被穿孔以使营养流到达培养室，并且必须建立传感器箔的安装过程。