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Presens 荧光法残氧仪 MIC监测实时 3D 癌症球体中的耗氧量

更新时间:2024-02-20  |  点击率:272

     局部氧梯度存在于所有组织中,无论是天然的还是工程的。组织氧合影响细胞迁移、增殖和分化。缺氧环境对于某些发育过程是必要的,例如胚胎和成体干细胞需要特定的氧张力来维持其多能性、分化或维持其分化。然而,缺氧微环境也是癌症组织的共同特征,因为它们的新陈代谢上调。多细胞肿瘤球体 (MCTS) 被认为是使用体内或体外肿瘤材料的有用体外替代方案。它们是研究抗癌药物效果的有力工具,因为它们代表了 2D 单层细胞和常规组织结构之间的中间体。了解球状体及其不同区域(增殖区、静止区、坏死区)内的氧合状态对肿瘤研究至关重要。例如,中央球状体区域缺氧会导致核心静止或坏死。氧合状态可作为抗癌药物疗效的指标,有助于识别和选择合适的个性化药物。关于活体 3D 细胞培养物中的时间和空间分辨氧合和缺氧的信息仍然缺乏适当的生物相容性测量技术。在这里,我们提出了一种技术,该技术允许在较长时间的生长条件下对3D细胞培养模型进行空间和时间分辨监测。它可以在正常培养系统内进行自动、非侵入性测量,并提供 2D 横截面氧分布。

材料与方法

    使用二维氧成像系统VisiSens TD(PreSens,Regensburg,Germany)记录时空梯度,该系统带有一个特殊的显微成像附件,该附件由显微镜镜头和适配激发光源(VisiSens TD MIC Kit)组成。SF-RPSu4氧传感器箔(PreSens,Regensburg,Germany)用于定量局部O2浓度。使用VisiSens ScientifiCal软件进行单图像2D映射或时间序列图像采集以及图像评估。传感器在37 °C下使用0 %和100 %空气饱和介质进行两点校准。

   O的碎片2用硅胶(SG-1型)将传感器箔(生长面积为0.385 cm²)粘在直径为3.5 cm的标准培养皿的底部。白色光学隔离层从传感器箔上剥离。用氩等离子体处理具有集成传感器的培养皿 1 分钟,并用 150 μl 胎牛血清 (FCS) 包被氧敏箔以支持细胞粘附。在传感箔周围放置一个直径为 0.7 cm 的圆形 PDMS 腔室,以简化球体的播种并在附着阶段将其保持在适当的位置。在氧传感器箔区域加入100μl含有单个3D培养球体(起始细胞数3000;直径约500μm)的MCF-7培养基。培养皿的周围区域被MCF-7培养基淹没,以防止样品变干。将球状体附着在氧敏感基质表面24小时(37°C,5%CO2).

    图1:采用MIC配置的VisiSens TD氧气成像系统图像(左)。小型化允许将检测器和激发单元集成到标准细胞培养箱中。传感器箔粘在细胞培养培养皿的底部,培养皿可以放置在读出单元的样品架上。MCF-7 球体在粘附在传感器箔片上时形成半球形结构(右)。生物相容性氧敏箔由成像系统的 LED 激发,发射由灵敏相机映射。自动测量由VisiSens ScientifiCal软件控制。

结果

     播种后,球体固定在传感器箔上,附着在2D传感器箔上并构建半球形结构。CaAM染色后,通过共聚焦激光扫描显微镜确认半球形和附着在传感器箔上的附着(见图2A)。3D 组织的渗透性和透明度有限,阻碍了染料的扩散和激发光穿透到球体的更深部分。因此,CaAM在外球体区域的活细胞中显示亮绿色荧光,球状体内有黑色区域。来自原始球状体的一些细胞长出并扩散到半球周围。红色发光由传感器箔发出。连接到平面氧传感器箔的半球形结构能够记录球体和传感器箔之间的接触区域的直接横截面二维氧图,并可视化其中的任何梯度。成像系统聚焦在具有粘附球体的传感器箔上。在12小时内每15分钟自动拍摄一次图像,以证明长期监测球体横截面的可能性。

    图2:(A)MCF-7球体在传感器箔上的相差显微照片(左)和附着在传感器箔(红色)上的CalceinAM染色半球形球体(绿色)的3D共聚焦激光扫描显微照片。(B) 在生长条件下 12 小时时程内绘制时空氧浓度的图像系列。氧浓度以伪彩色给出。(C) 三个典型感兴趣区域的氧合时间变化的比较:球状体区域周围的散装介质(矩形 ROI)、球状体外缘和中心部分的增殖区(圆形 ROI)。比例尺 200 μm。

   图 2B 显示了在生长条件下沿 12 小时时间序列以伪彩色显示的 MCF-7 球状体横截面的示例性 2D 氧图。在0h时,将新鲜培养基加入培养皿中,引起再氧化。球体的内核在前两个小时内迅速再次变为缺氧,从伪色标的紫色和蓝色中肉眼可以清楚地看到。在2D氧图中,通过球状体区域的氧梯度也变得清晰可见。除了视觉伪彩色表示外,VisiSens评估程序还允许自由选择氧气图像中不同部分的感兴趣区域(ROI),提供所选区域的平均值和统计数据。氧气浓度范围为全氧合介质(pO2150 至 160 torr),到通过增殖区(100 至 50 torr)的陡峭梯度和球体中心的缺氧静止区(低至 20 torr)。基于图像的氧气映射的另一个优势是,可以随着时间的推移研究不同的ROI,从而深入了解整个实验中的时间变化。图 2C 显示了 12 小时内培养基、增殖区和球状体缺氧核心的比较


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