使用Presens SFR 一次性摇瓶培养条件的测定和设计

       溶解氧（DO）是好氧培养过程中的关键参数，由于其溶解度低，氧气在某些培养条件下会受到限制。本研究开发了一种预测一次性摇瓶中不同培养条件下氧转移速率、氧饱和度和最大细胞浓度的新方法。因此，确定体积气液传质系数（kLa）从灌装量、容器尺寸和搅拌速度已经确定。使用SFR摇瓶读数仪进行氧气测量。谷氨酸棒状杆菌的测试表明，使用这种新方法可以实现可靠的培养条件设计，并且可以不受限制地预测最大可能的细胞浓度。

图1：本研究使用了带有集成化学光学传感器（SFS，PreSens）的挡板（左）和非挡板（右）一次性摇瓶。

       摇瓶具有多种优点，例如易于操作和高通量，因此广泛用于研究和工业。这就是为什么已经在几项研究中研究了摇瓶中的溶解氧浓度和传质。然而，这些信息从未用于实验设计中的初步考虑，或好氧培养中DO的预测，尽管这将具有显着的优势并防止由于氧气限制而导致的失败。在这项研究中，我们开发了一种可靠预测有氧生长过程中氧饱和度的方法。随着带有集成传感器的一次性培养容器市场不断增长，我们的实验集中在这种类型的塑料摇瓶上。我们对 k 进行了系统调查L一个带和不带挡板的一次性摇瓶，并使用SFR摇瓶阅读器实现氧气监测，允许在容器中进行在线监测。得到的 k 的数学相关性L然后对谷氨酸梭菌的模型培养进行计算，并事先确定在没有氧气限制的情况下可以获得的最大细胞浓度。

图2：k的相关性La，30°C下填充体积为10%的挡板摇瓶的烧瓶尺寸和振荡频率。

     图3：以葡萄糖为碳源的矿物盐培养基中谷氨酸的生长和耗氧量。在250 mL挡板摇瓶中进行培养，填充体积为30%（A）和10%填充体积（B），转速为150rpm。该设置中的非氧限制期（灰色区域）用于确定比生长速率、μ和比摄氧速率 qO2预测值（蓝色）和实验数据（黑色）显示出好的一致性（B）。

材料与方法

      kLa在不同尺寸（125、250、500 mL）的挡板和非挡板摇瓶中定量，并带有集成的氧气和pH传感器（SFS传感器烧瓶，PreSens）。在100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，在30和37°C的轨道摇床中进行测量，振荡直径为50 mm。 使用SFR摇瓶读数仪（PreSens）实现溶解氧监测。摇瓶用缓冲液和Co（NO）平衡3)2（0.1 毫米）。通过添加 200 gL 获得缺氧-1那2所以3储备溶液。工作体积（10 - 40 %最大填充量）和振荡频率（50、150、250 rpm）各不相同，所有测量一式三份进行。kLa使用Berkley MADONNA（Ver.8.0.1）测定血氧饱和度的20-90%。对于 kL估计值、烧瓶大小、振荡频率和 K 之间的经验相关性La 根据实验数据汇编。数学拟合要么使用高斯函数，要么使用抛物线函数[1]。C. 谷氨酸ATCC 13032用矿物盐培养基培养。培养物在250mL挡板摇瓶（SFS，PreSens）中生长，温度为30°C，150rpm，填充体积为10%或30%。后者用于确定比生长速率和比摄氧速率。这些实验确定的生长和摄氧值用于预测谷氨酸梭菌在30 °C，150 rpm下在250 mL摇瓶中以10%填充体积生长期间生物质浓度的增加和DO的降低。

kL摇瓶中的定量

      kLa是通过在充满缓冲液的挡板和非挡板摇瓶中进行在线氧气监测来确定的。通过添加Na去除氧气2所以3到系统。当氧化还原反应由Co催化2+完成，烧瓶内的溶解氧增加，可用于测定KLa 对于给定条件。对于所研究的摇瓶，kL值长达350小时-1都下定了。对于无挡板摇瓶，kLA 总体较低，最大 KLa 值为 100 小时-1[1]. 摇晃频率对氧气转移的影响显著。容器尺寸对k几乎没有任何统计学相关影响La的无挡板摇瓶，但对k有一定影响L一个在困惑的烧瓶中。从30°C到37°C的温升几乎没有影响kL一个。然而，对于每个研究的填充体积，在30和37°C下建立了个体相关性。在图2中，这是在30°C下以10%填充体积的挡板摇瓶所示的。获得了k的高斯拟合的优参数估计L挡板烧瓶和 K 抛物线拟合的值La 非挡板烧瓶的值。

谷氨酸的生长和耗氧量

      图3 A显示了谷氨酸梭菌培养物在250 mL摇瓶中的生长和耗氧量，填充量为30%，振荡频率为150 rpm。可以观察到，DO下降得非常快，并在4小时后变得受限。测定生长和摄氧量至0.38小时-1和 14.2 毫摩尔克-1h-1分别。这些值用于预测细胞生长的时间过程和在另一个迄今为止未经测试的条件下培养谷氨酸梭菌的溶解氧。计算在250 mL挡板摇瓶中进行实验设置，填充率为10%，振荡频率为150 rpm。kLa计算至190小时-1接种物浓度为 0.2 g CDW L-1确定细胞生长的时间过程，如图3 B（蓝色实线）所示;考虑到所有参数，计算了DO（蓝色虚线）。在进行实验和监测培养性能时，可以验证氧气消耗量确实得到了很好的预测。实验值和预测值几乎相同。限制氧气供应时的预期细胞浓度（4.3 g L-1） 也与实验实现的 4.6 ± 0.3 g L 的细胞浓度相匹配-1在 20% 的 DO 下。

结论

      本研究结果清楚地表明，该方法可用于预测一次性摇瓶的最佳培养条件和耗氧量。随着已建立的相关性 kL计算可以从基于缓冲液的系统转移到标准摇瓶培养。预测特定实验装置的氧气可用性的能力可以显着改善实验设计。SFR系统专为一次性摇瓶中的氧气监测而设计，在这项研究中被证明是一个有价值的工具，为这种新方法的开发及其后续验证提供了基础数据。