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缺氧对GDH活性的影响 Presens摇瓶培养物中的氧监测

发表时间:2023-01-10  |  点击率:251

image.png杯垫CFG上方的摇瓶用于读取光学传感器

     研究了不同栽培条件下谷棒状杆菌和两种不同白喉棒状杆菌培养物中缺氧的影响。进行实验以表征低氧浓度对氮代谢的特定酶 - 铵转移酶谷氨酸脱氢酶(GDH)的影响。Oxgyen监测使用PreSens的氧气仪Fibox 3进行。所有测试的棒状杆菌培养物的生长速率取决于氧气供应,并且可用的氧气越多,生长速率就越高。所研究的GDH活性似乎不受谷氨酸C.低氧水平的影响。在白喉衣原体培养物中,GDH活性在某些条件下增加,但只能确定非常低的活性值,这可能不显着。

     铵的同化,被称为谷氨酸C.的氮源,主要通过NADPH依赖性谷氨酸脱氢酶(GDH)完成。该酶将铵转化为L-谷氨酸,这使得GDH成为一种生物技术上重要的酶,因为食品工业需要大量谷氨酸作为增味剂。因此,一个目标是提高GDH的效率。在谷氨酸梭菌和白喉梭菌等需氧细菌中,氧限制会影响新陈代谢,也可能损害GDH活性。在T. Müller[2]先前的研究中,可以观察到在氧气排除下谷氨酸C. gdh的转录减少。以下实验进一步研究了缺氧对谷氨酸衣原体和白喉梭菌培养物生长速率、GDH活性和GDH转录的影响。测试具有不同培养体积和振荡速度的不同培养条件。Fibox 3与化学光学氧传感器一起用于在整个培养期间培养物中的非侵入性氧监测。

材料与方法

    实验使用300 mL挡板玻璃摇瓶,其中一些在内底壁上附有氧传感器点(PreSens)。杯垫CFG是一个适配器,放置在传感器点正对面的摇瓶下方,并通过PreSens连接到氧气计Fibox 3以读取传感器响应。在整个培养过程中以30秒的采样率监测和记录氧气浓度。本研究使用了谷氨酸梭菌ATCC13032野生型菌株和两种白喉梭菌野生型菌株DSM44123和DSM43988[1]。为了检查不同培养条件下的耗氧差异,在125 rpm的振荡速度下,体积为25 mL、50 mL和100 mL,并在100 rpm和150 rpm的振荡速度下测试了另外两种50 mL体积的培养物。对于每一系列测试,在摇瓶中接种四个平行培养物。在每个系列中,取三个15mL样品,每个样品来自单独的培养容器,用于谷氨酸脱氢酶活性测量和RNA杂交:0.5小时,2.5小时和6.5小时后。剩余的摇瓶装有用于氧气监测的传感器点。gdh DNA片段通过集落PCR扩增,随后通过凝胶电泳纯化,并用NucleoSpin®提取物试剂盒(Macherey-Nagel,Düren)提取。GDH活性按照T. Müller[2]的描述进行测量,并用以下公式计算:

活动 = (ΔA x V) / (ε x t x m x d)

     Delta A是吸光度降低,V是总反应体积。Epsilon是消光系数,t是反应时间,m蛋白在反应混合物中(mg)和d层厚度。用Roti-Quant®在oD下测量反应混合物中的蛋白质595.使用NucleoSpin® RNA II-Kit (Macherey-Nagel, Düren)进行总RNA的分离。标记的RNA探针的合成和RNA杂交按照E. Hänssler的描述进行[3]。

图1:不同体积(A)和不同振荡速度(B)的谷氨酸梭菌培养物的氧浓度和oD。

图2:谷氨酸梭菌培养物中的氧浓度和GDH活性(A);白喉衣原体DSM44123和DSM43988培养物中GDH活性的比较(B)。

氧气消耗和增长率

       将培养0.5、2.5和6.5小时的氧气水平与当时的光密度进行比较(图1)。可以观察到,谷氨酸衣原体和白喉衣原体的生长速率取决于氧气供应。不同的条件,如不同的振荡速度和培养量,导致氧气供应的变化。总之,可用的氧气越多,生长速度就越高,与已知的数据相匹配。在培养快速生长的细菌(如谷氨酸梭菌)时,监测生长速率和氧气浓度的相关性非常重要。因为,例如,与以125 rpm摇动的培养物相比,用150 rpm摇动的谷氨酸C. glutamum培养物显示出更低的氧气水平,但OD更高,这可能导致氧气随着时间的推移而耗尽。像白喉梭菌这样生长缓慢的细菌的耗氧量非常低,因此它几乎与氧气输入保持平衡。在所有系列实验中,耗氧量都超过了氧气输入,浓度降低。没有系列达到氧气限制。

缺氧对GDH的影响

      比较谷氨酸C. glutamum的GDH活性和氧气消耗没有显示出很强的相关性(图2A);氧气的减少导致GDH活性的强弱下降。此外,在氧气减少与gdh转录本量之间没有显着相关性。GDH活性的降低在6.5小时内为0.25-0.7U / mg。这些值非常低,可能是由波动或其他调节过程的结果引起的。然而,不能排除氧气消耗对GDH活性的影响。与谷氨酸衣原体相比,在某些培养条件下,在白喉梭菌的两个菌株中都可以观察到GDH活性略有增加(图2B)。但是测量值真的很低,可能并不重要。两种白喉菌株培养过程中氧浓度均或多或少降低,GDH活性均增加和降低。白喉衣原体DSM44123的斑点印迹显示转录本增加(25mL / 125rpm除外),这与GDH活性测量无关。这可能表明谷氨酸脱氢酶在转录后受到调节。白喉梭菌DSM43988菌株中的斑点印迹和GDH活性测量或多或少匹配,但与白喉梭菌DSM 44123获得的结果不匹配。由于两种菌株的结果不同,无法得出关于缺氧对白喉衣原体GDH的影响的明确结论。

结论与观点

       在测试的培养条件下,在谷氨酸衣原体和白喉衣原体的培养物中,氧浓度对GDH活性没有一定的影响。由于只能测量非常低的GDH活性值,因此必须使用大量蛋白质进行进一步的测试。谷氨酸梭菌培养的结果并未证实在T. Müller研究中观察到的预期影响[2]。其他条件可能必须进行测试,例如以更低的摇晃速率或不摇晃进行栽培。由于氧气的减少有望降低GDH活性,因此相反的方法 - 额外的氧气输入 - 可以提供更详细的见解。这些新方法可能会为GDH活性测量提供更好或更显着的结果


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